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Home > 專利與醫療 > 自然殺手細胞增生專利
 
自然殺手細胞體外複製三代來的比較
  發明人 發明國家 發明申請時間
與通過時間		 發明特點
第一代 大野忠夫 TADAO OHNO
西條薰 KAORU SAJJOH 		日本
（在台灣有註冊發明） 		2000-2002
（台灣案號89125163） 		可以複製自然殺手細胞 50倍到300倍、
活性30-70%
第二代   美國 2006-2008 可以複製自然殺手細胞 100倍到500倍、
活性30-70%
第三代 李光輝 KUANG-HUI LEE 台灣
（在中國、日本註冊發明）		 台灣2010.12.31
中國2011.2.12
（台灣申請案號：099147397
大陸申請案號：201110036393.8 ）
-2013 		可以複製自然殺手細胞 500倍到1000倍、
活性60-90%

各國實施自然殺手細胞體外複製的現況
  台灣 中國內地（年） 日本（年） 美國（年）
法律規範 無 合法
(2009.3) 		合法
(1990)		 合法
(1990、不同州)
保險幾付 無 有
（2萬RMB到5萬RMB，
自付額10%）		 有
（33萬日元）		 Dendroson公司針對前列腺癌，
私人保險，每針6000美元

人類自然殺手細胞之體外增殖方法 (概述如下)
（發明人：李光輝 博士； 台灣申請案號：099147397　；大陸申請案號：201110036393.8 ）

本發明之目的，在於提供一種人類自然殺手細胞之體外增殖方法，其係可以從冷凍保存之周邊血液單核球細胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中增殖CD3-CD56+亞型自然殺手細胞的方法，使自然殺手細胞經本方法增殖過後，可達到至少高於增殖前五百倍的細胞數目，並保持自然殺手細胞之毒殺活性，為人類自然殺手細胞在用於製備腫瘤疫苗等醫療藥物組合時提供一種切實可行的方法。

本發明之又一目的，在於為腫瘤NK細胞療法提供了一種切實可行的醫療方案和技術，例如將使用本發明之增殖技術所培養而得之NK細胞用於製備腫瘤疫苗等醫療組成物。 為更好的描述和理解本發明，我們將對本發明中所涉及的術語做詳盡的解釋。
自然殺手細胞(Natural killer cells ,NK cells)：NK細胞是一群不同於T、B 淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞，分佈於周邊各淋巴器官及血液循環系統，無需抗原的預先刺激與活化即可發揮細胞毒殺效應，並可分泌多種細胞因子及趨化因子。

NK細胞的啟動：NK細胞可表達一系列活化性受體及抑制性受體，兩者間的平衡是控制NK細胞是否被啟動的重要機制。同時，干擾素及巨噬細胞來源的細胞介素均是NK細胞極強的活化因子。本發明中是利用重組人類白血球間素，應用來活化NK細胞。
NK細胞的增殖：是指NK細胞在體外培養中通過一系列的細胞分裂，而達到一定的增殖數目。本發明中所增殖的NK細胞主要是CD3-CD56+亞群的NK細胞。

細胞毒殺活性：是指由細胞引起的單純的細胞殺傷事件。NK細胞的毒殺活性不單純侷限於腫瘤細胞，還包括對病毒感染細胞、受損和功能異常細胞的殺傷作用。本發明中所涉及的NK細胞毒殺活性主要是指其對腫瘤細胞的殺傷作用。NK細胞毒殺活性的測定目前主要是應用對NK細胞敏感的骨髓白血病(erythroleukemia)細胞株K562和對NK細胞抗性的淋巴腫瘤細胞株Raji為靶細胞，測定NK細胞對它們的殺傷率。本發明中應用K562細胞株來測定NK細胞毒殺活性。

NK細胞療法：是一種利用高科技之細胞培養技術在短時間內於體外（Ex vivo）大量繁殖病人本身可以對抗癌細胞的NK細胞後，再將其注入病人體內，直接提高病人本身之抗癌能力，達到抗癌、治癌目標的一種醫療技術。NK細胞療法的前提是NK細胞的啟動和大量增殖，並對腫瘤細胞保持高的細胞毒殺傷活性。 自體免疫細胞，尤其是NK細胞的免疫細胞治療法簡單的說，是一種利用高科技之細胞培養技術在短時間內於體外（Ex vivo）大量繁殖病人本身可以對抗癌細胞的NK細胞後，再將其注入病人體內，直接提高病人本身之抗癌能力。實際的做法是病人經醫師仔細評估且判定適合NK細胞療法後，從病人身上採集約30毫升之周邊血液在符合GTP/GMP規範之無塵、無菌實驗室進行連續15天的培養，在過程中以特殊之配方專門培養、增殖其中之NK細胞，使其數量增加達原先之數百倍甚至上千倍後再注入體內，直接提高NK細胞之數量進而達到治療癌症之目的。

利用 NK 細胞療法來治療癌症有下列各種學理上之優勢：
一、 NK 細胞是人體內抗癌活性最強的細胞，可直接殺死癌細胞抑制腫瘤的生長及擴散；
二、 NK 細胞會抑制腫瘤附近新血管的增生，故可限制腫瘤取得所需要的養份進而限制腫瘤之生長；
三、 NK 細胞可直接改善並調節患者之免疫力及神經系統，間接提高患者之生活品質；
四、 NK 細胞會分泌一種叫做 b -endorphin 的腦內啡，可減少病患之疼痛令病患有愉悅感，間接提升生活品質；
五、副作用低或幾乎無副作用。目前一些研究已指出，周邊血液自然殺手細胞所具有的毒殺範圍除了包括黑色素瘤、頭頸癌之外，還有肺、卵巢、子宮頸、膀胱、攝護腺、肝細胞、胰臟、食道、乳房及許多合併的癌症。尤其對肺癌、淋巴癌、食道癌、乳癌、肝癌等血流旺盛且血管較密集地區之癌症較有效。

一般的狀況下，我們身體以部位計算，會有 5到15顆的癌細胞產生，那時，只要一顆NK細胞，就可以殺光這些癌細胞。但是，一但得了癌症，每一顆癌細胞，要250顆當時體內的NK細胞，才能殺死。因此，儲存未得癌症前的戰鬥力高的NK細胞，在萬一未來得癌時，複製成多數，再注入身體以協助抗癌，是目前最有效、無副作用的輔助方法。

本發明提供的NK細胞增殖之方法，滿足NK細胞療法的條件，為腫瘤NK細胞療法提供了一種切實可行的醫療技術。
本發明人等欲解決腫瘤NK細胞療法之課題經銳意研討結果，發現從凍存周邊血液單核球細胞啟動、增殖NK細胞之方法。所增殖NK細胞是具有高腫瘤細胞毒殺活性的CD3-CD56+亞群。細胞培養條件在實施例中詳細描述。根據本發明實施例結果，周邊血液單核球細胞在體外培養5天後，NK細胞開始增殖，發明人等稱之為啟動階段，在後續的1到10天過程培養中，發明人等稱之為增殖階段，NK細胞會繼續增殖至100到500倍，甚至到1000倍。

根據本發明實施例結果，啟動並增殖的NK細胞與非體外增殖的NK細胞相比，細胞毒殺活性至少增加了100%，較好者增加了150%到200%，甚至最好者增加了400%。本發明中非體外啟動並增殖的NK細胞是指採用CD56 抗體磁珠，陽性分選的新鮮NK細胞。啟動並增殖NK細胞的細胞毒殺活性之所以增高可能是由於結合受體表達上調所介導的一種效應。

本發明的實施例中描述了前述NK細胞啟動、增殖之具體方法。需要強調的是，在以冷凍保存之周邊血液單核球細胞啟動、增殖NK細胞的培養體系中，由於周邊血液單核球細胞是包含不同細胞群的混合物，例如CD3+CD56-亞群的NK細胞、NKT細胞（CD3+CD56+）和T細胞（CD3+），所以在啟動增殖後，除了大量增殖的CD3-CD56+亞群NK細胞外，還有其他細胞類型在啟動增殖的培養體系中存在。

根據本發明實施例結果，發明人等亦詳細設計了NK細胞的臨床施用方案。發明人等在一系列的NK細胞培養及其狀態的觀察過程中，發現NK細胞的最佳狀態在培養的第9到14天。根據細胞狀態，發明人等將在第9-10天和13-14天換無血清培養基培養，48小時後換液，再經24小時其狀態達到最佳，NK細胞的數目達到10-80億之間。因此，此時為進行細胞回輸至人體的最佳時機。

根據本發明中NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒殺活性，本發明包括NK細胞能與其他癌症治療手段聯合給藥或應用。例如與手術、放療和細胞毒性藥物的聯合應用。同時，本發明相關的研究結果提示：體外啟動增殖的NK細胞與體內未啟動的NK細胞相比具有明顯的抗腫瘤能力。因此本發明亦包括了NK細胞對腫瘤的殺傷作用。而所說的腫瘤細胞是指自體腫瘤細胞。自體腫瘤細胞是指來源和再植入的是同一個體的細胞，也就是說，供體和受體是同一個人。上述的自體腫瘤細胞包含了血液腫瘤及實體腫瘤。

與以往NK細胞增殖發明之方法比較，本發明包含以下幾點明顯的不同或優勢：
1. 本發明係抽取健康人類個體的周邊血液，取出其中之周邊血液單核細胞（PBMCs)以進行NK細胞的增殖，較之習知技術可以確保NK細胞之活力、品質、與毒殺活性皆處於健康而良好有效的狀態。
2. 本發明在NK細胞增殖過程中，刺激增殖NK細胞，更有效的保證了NK細胞具有高的細胞毒殺傷活性。
3. 本發明之增殖方法可以使得NK細胞在增殖後達到至少高於增殖前細胞數目五百倍的細胞數量。
4. 本發明在NK細胞增殖過程中，採用自體血清進行培養，使NK細胞腫瘤治療方案更加安全。

本發明中採用不同幹細胞培養基混合培養NK細胞方案，有效降低了NK細胞增殖之成本，也為NK細胞在用於製備腫瘤疫苗等醫療藥物組合時提供一種切實可行的方法。

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